Einführung in die Mikroskopie-Techniken


Eine der bemerkenswertesten und besten Internet-Resourcen zum Thema Mikroskopie ist die Themensammlung, welche von der Florida State University unter Molecular Expressions™ Exploring the World of Optics and Microscopy bereitgestellt wird. Die Website behandelt alle wesentlichen Aspekte der Mikroskopie von Einführungbeiträgen bis hin zur Erläuterung der modernsten und aufwändigsten Techniken und beinhaltet einschlägige Suchmaschinen und Themensammlungen. Ergänzt durch Bildmaterial und Demonstrations-Applets, welche die Techniken anschaulich erläutern, ergibt sich ein Referenzwerk, welches gleichermassen 'Einsteigern' die faszinierende Welt der Mikroskopie und ihre Techniken näher bringt, wie auch selbst 'Fortgeschrittenen' neuere oder sehr spezialisierte Aspekte der Mikroskopie.
Die Molecular Expressions™ Website ist so umfangreich und übersichtlich aufgebaut, dass eine Erläuterung nicht nötig ist, es werden daher hier in Form von Hyperlinks nur einige der interessantesten Mikroskopie-Techniken in einer Art und Weise herausgegriffen, die zum weiteren Studium anregen sollen.
" Hellfeld-Mikroskopie"
" Dunkelfeld-Mikroskopie"
" Polarisations-Mikroskopie"
" Phasenkontrast-Mikroskopie"
" Differenzielle Interferenzkontrast-Mikroskopie"
" Fluoreszenz-Mikroskopie"
" Schiefe Beleuchtung"
" Rheinberg-Beleuchtung"
" Dekonvolutions-Mikroskopie"
" Confokale Mikroskopie"

Hellfeld-Mikroskopie
Während die Auflicht-Mikroskopie speziell für Materialuntersuchungen eingesetzt wird, ist die Durchlicht-Mikroskopie mit der Hellfeld-Darstellung die nach wie vor gängigste mikroskopische Betrachtungsmethode. Sie geht auf Antonie van Leeuwenhoek zurück und blickt daher auf eine mehr als 300-jährige Geschichte. Bei ihr wird das zu betrachtende Objekt vor einem hellen Hintergrund dargestellt, und Beispiele für Durchlicht-Betrachtungen werden wohl jedem bekannt sein, der sich je mit mikroskopischen Abbildungen auseinandergesetzt hat (Brightfield Microscopy Digital Image Gallery). Darüber hinaus sind jedoch weitere Betrachtungstechniken etabliert, die teils als Alternativen, teils aber auch als mehr oder weniger einzige Möglichkeiten der Betrachtung bestimmter Objekte geeignet sind.

Dunkelfeld-Mikroskopie
Die Dunkelfeld-Mikroskopie stellt die Strukturen des Objekts vor einem dunklen Hintergrund dar. Dies wird dadurch erzielt, dass durch ausschließlich schräge Beleuchtung des Objektes kein ungestreutes Licht über die Objektebene hinaus auf das Objektiv trifft. Benötigt wird dazu lediglich eine im Durchmesser auf das jeweilige Objektiv abgestimmte runde Dunkelfeld-Blende im Strahlengang unterhalb des Objektes, die in den gängigen Universalkondensoren üblicherweise enthalten oder zumindest einsetzbar ist. Abbildungsbeispiele finden sich in der Darkfield Microscopy Digital Image Gallery.

Polarisations-Mikroskopie
Ebenfalls mit unmodifizierten Objektiven arbeitet die Polarisations-Mikroskopie, bei der die doppelbrechenden Eigenschaften bestimmter Objekte wie beispielsweise von Kristallen genützt werden, um ein im normalen Durchlicht zwar meist ebenfalls sichtbares Objekt, allerdings wesentlich kontrast- und farbreicher darzustellen. Wesentliche Zusatzeinrichtung für die Polarisations-Mikroskopie ist die Einbringung eines Polarisators in den Strahlengang des Mikroskops vor dem Objekt, und eines Analysators nachdem das polarisierte Licht das Objekt durchlaufen hat. Die zunächst auslöschende Wirkung einer gekreuzten Polarisator- / Analysator-Kombination resultiert bei doppelbrechenden Strukturen in Interferenzbildungen, die nicht nur für die Abbildung bestimmter Objekte unumgänglich sind, sondern auch zu den schönsten Darstellungsvarianten der Mikroskopie gehören. Beispiele finden sich in der Polarized Light Digital Image Gallery. Da eine Polarisator- / Analysator-Kombination grundsätzlich relativ preiswert zu beschaffen sein kann sollte bei Überlegungen zur Anschaffung eines neuen Mikroskops immer auch die Möglichkeit in Betracht gezogen werden, den Polarisator (meist mittels eines Filterauflagerings) und den Analysator (meist mittels eines Tubus-Einschubs) in den Strahlengang einbringen zu können.

Phasenkontrast-Mikroskopie
In den 1930-er Jahren wurde vom niederländischen Physiker und Nobelpreisträger Fritz Zernicke eine Technik entwickelt, die es erlaubt, in kontrastarmen sog. Phasenobjekten kleine Phasenänderungen aufgrund ihrer Brechungseffekte kontrastreich darzustellen. Die Phasenkontrast-Mikroskopie arbeitet ebenfalls mit Blenden im Strahlengang unterhalb des Objektes, meist in einem Universalkondensor liegend. Anders als bei der Dunkelfeld-Mikroskopie sind es hier allerdings Phasenring-Blenden, die in ihren Abmessungen mit Phasenplatten korrespondieren, die in speziellen Phasenkontrast-Objektiven eingesetzt sind. Verbreitet sind die Bezeichnungen Ph I, Ph II und PH III, die an die Objektivspezifikation angehängt sind und die zum jeweiligen Objektiv passende Phasenring-Blende beschreiben. Vor allem aufgrund der speziellen Phasenkontrast-Objektive folgt bereits, dass es sich hier um eine etwas aufwändigere Technik handelt, wobei allerdings die Aufpreise von Phasenkontrast-Objektiven ggü. entsprechenden Objektiven ohne Phasenkontrast-Ring im relativ moderaten Bereich liegen. Hier lohnt es sich also ebenfalls, im frühen Planungsstadium Preisvergleiche anzustellen um bei der Anschaffung der entsprechenden Objektivserie die richtige Entscheidung für die allenfalls später gewünschte Phasenkontrast-Methode zu treffen. Zu beachten ist, dass bei der Phasenkontrast-Mikroskopie bei zunehmender Probendicke verstärkt sog. Haloeffekte auftreten, sie ist also eine - heute durchaus noch sehr gebräuchliche und nützliche - Kontrastierungsmethode für tendenziell dünnere Proben. Beispiele finden sich in der Phase Contrast Microscopy Image Gallery.

Differenzielle Interferenzkontrast-Mikroskopie
Während die in den 1950-er Jahren vom französischen Optiker Georges Nomarski entwickelte Diffenzielle Interferenzkontrast-Mikroskopie (DIC) nach physikalisch / optisch anderen Prinzipien arbeitet, ist sie als Alternative zur Phasenkontrast-Mikroskopie ebenfalls zur kontrastreichen Darstellung von Phasenobjekten geeignet. Von diesen liefert der DIC eine Dreidimensionalität-simulierende monochrome Abbildung, in der Phasenänderungen des Objekts in Kontrastunterschiede umgewandelt werden. Der DIC unterliegt nicht der Halobildung des Phasenkontrastes und eignet sich auch für die Darstellung nicht allerdünnster Objekte. In diesen wird im DIC sogar eine Art 'Schärfenebene' selektiert bzw. mehr oder weniger 'herausgefiltert', wodurch sich die Technik u.a. für z-Stapelaufnahmen besonders eignet. Der DIC arbeitet ebenfalls mit polarisiertem Licht, welches unterhalb des Objektes durch ein (Wollaston- oder Nomarski-) Prisma in zwei orthogonal verschobene Strahlengänge geteilt wird, die nach Durchlaufen der Probe und des Objektivs zunächst durch ein zweites (Wollaston- oder Nomarski-) Prisma (DIC-Schieber, meist kontrastverändernd justierbar) wieder vereinigt werden, bevor ein Analysator passiert wird. Die Voraussetzungen für DIC sind daher nicht nur die relativ kostspieligen Prismen, sondern neben der schon für die Polarisations-Mikroskopie benötigten Polarisator- / Analysator-Kombination zusätzlich eine DIC-Schieber-Aufnahme im Strahlengang oberhalb des Objektivs, üblicherweise durch einen speziellen Objektivrevolver. DIC ist sowohl mit Phasenkontrast-Objektiven, als auch solchen ohne Phasenkontrast-Ring möglich, bei entsprechender Ausrüstung kann also an ein und dem gleichen Gerät alternativ sowohl Phasenkontrast als auch DIC realisiert werden, was bei schwierigeren Phasenobjekten durchaus ergänzende Informationen liefern kann. Beispiele für DIC-Aufnahmen finden sich in der Differential Interference Contrast Digital Image Gallery.

Fluoreszenz-Mikroskopie
Als letzte wesentliche 'klassische' Kontrastierungsmethode ist hier die Fluoreszenz-Mikroskopie zu nennen, die auf die Entdeckung des britischen Forschers Sir George Stokes zurückgeht, dass gewisse Stoffe unter der kurzwelligen UV-Beleuchtung Strahlung grösserer Wellenlänge aussenden. Die Stokes-Verschiebung gibt den Abstand zwischen der Wellenlänge an, bei der das Leuchten des Farbstoffs am besten angeregt wird, und jener Wellenlänge, bei der das meiste Licht abgestrahlt wird. Fluoreszenz-Mikroskopie wird überwiegend im Auflicht durchgeführt, was separate Lichtführung von UV-Licht bedingt, sowie den Einsatz von Teilerspiegeln im Strahlengang oberhalb des Objektes. Seit etwa den 1930-er Jahren hat sich die Fluoreszenz-Mikroskopie vor allem in der Histologie und Bakterienforschung etabliert und erfreut sich heute in einem Umfeld intensiver medizinischer Forschung im Bereich der Zellbiologie aufgrund inzwischen ausgefeilter Gerätetechnik und der anwendungsspezifischen Entwicklung modernster Fluorochrome in diesem Bereich grössten Interesses. Neben den bis dato zum Einsatz kommenden Quarz- oder Xenon-Beleuchtungen sind die Voraussetzungen für Fluoreszenz-Mikroskopie meist der Einsatz geeigneter Fluorochrome, weiters sehr lichtstarke Objektive, Teilerspiegel für die jeweiligen Anregungs- und Emissionsspektren, hochwertige Digitalkameras für Langzeitbelichtungen, vorzugsweise mit Digitalrauschen-unterdrückender Kühlung, und - nicht zu vergessen - Vorkehrungen für den Augenschutz aufgrund der Gefährlichkeit der UV-Strahlung. Insgesamt also sowohl von den Anwendungsbereichen, als auch von der Geräteausstattung jedenfalls im Grenzbereich selbst für fortgeschrittene Mikroskopiker gelegen, eröffnet die Fluoreszenz-Mikroskopie nichtsdestoweniger faszinierende Einblicke vor allem in die Bereiche der Grundlagen des biologischen Lebens. Beispiele finden sich in der Fluorescence Microscopy Image Gallery. Nicht unerwähnt sollte die Fähigkeit einer Reihe von Stoffen zur 'Eigenfluoreszenz' bleiben, die Fluoreszenz-Mikroskopie zumindest ohne Einsatz von Fluorochromen durchaus ermöglicht, da beispielsweise das dem botanisch interessierten Mikroskopiker laufend begegnende Chlorophyll die Fähigkeit zur Eigenfluoreszenz hat. Ein weiterer Durchbruch für die Fluoreszenz-Mikroskopie ist für jenen Zeitpunkt zu erwarten, wenn UV-LED's in geeigneten Ausführungen zur Verfügung stehen, eine Entwicklung, die bereits im Laufen ist.

Schiefe Beleuchtung
Die schiefe Beleuchtung wird unabhängig vom Kontrastverfahren relativ häufig eingesetzt, um Konstrastveränderungen und ggf. Auflösungssteigerungen zu erreichen.

Rheinberg-Beleuchtung
Leider etwas 'aus der Mode gekommen' ist die als optische Färbung einstufbare, an die Dunkelfeld-Mikroskopie anlehnende Rheinberg-Beleuchtung, zu der die benötigten Filter nur mehr relativ schwierig zu erhalten sind, obwohl die optischen Effekte sehr ansprechend sein können und abgesehen von einem Filterhalter keine aufwändigen Mikroskopzusätze nötig sind. Auf breiter Ebene weniger durchgesetzt hat sich der erst 1975 entwickelte Hoffmann-Modulations-Kontrast, möglicherweise nicht zuletzt auch deshalb, weil u.a. wiederum spezielle Objektive dafür benötigt werden (Beispiele: Hoffmann Modulation Contrast Microscopy Digital Image Gallery).

Dekonvolutions-Mikroskopie
Dekonvolutions-Mikroskopie und Confokale Mikroskopie (LSCM) werden hier nur am Rande erwähnt, da sie über den Rahmen dieses Artikels hinausgehende Spezialtechniken sind, die höchste Anforderungen an die Mikroskoptechnik und die Bildverarbeitung stellen. Sie haben das Ziel, systembedingte Unschärfen weiter zu reduzieren und zielen auf die dreidimensionale Darstellung optischer Präparatschnitte ab. Bei der Dekonvolutions-Mikroskopie werden im Fluoreszenzverfahren aufgenommene Bilderstapel mit einem Computer verarbeitet.

Confokale Mikroskopie
B ei der Confokalen Mikroskopie werden Proben computergesteuert von einem Laserstrahl abgetastet, die punktförmigen Bildinformationen gescannt, und mittels eines Computers zu Bildern zusammengesetzt.

Orchidee / Orchis spec.
O 2,5 / HF

Orchidee / Orchis spec.
O 2,5 / HF
Blutregenalge / Haematococcus pluvialis
O 40 / Phako

Blutregenalge / Haematococcus pluvialis
O 40 / DIC

Kartoffelstärke
O 20 / Pol

Kartoffelstärke
O 20 / DIC+RI

Referenzen
Autor: Helmut Reichenauer, © 2005 / Email : helmut.reichenauer@aon.at
Links: auf die Webseiten © 'Molecular Expressions™ 'Exploring the World of Optics and Microscopy' mit freundlicher Genehmigung der Florida State University
Präparate: Helmut Reichenauer / Frischpräparate